Optimering av reaktionsvillkor för att uppnå ett högt utbyte av stevia rebaudiosid d
Sockerrika dieter har lett till en ökande förekomst av olika kroniska sjukdomar, inklusive fetma, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och högt blodtryck, vilket utgör en betydande global folkhälsorisk. Stevia Rebaudioside D (Reb D), ett naturligt sötningsmedel härlett från växter, har fått stor uppmärksamhet som sockersubstitut tack vare sitt kalorifria innehåll, intensiva sötma och behagliga smakprofil.
Dess begränsade närvaro i stevia rebaudiana Bertoni och utmaningar relaterade till låg löslighet och enzymatisk aktivitet hos växtbaserad glykosyltransferas har dock hindrat dess utbredda kommersiella användning. Som svar på dessa problem upptäcktes ett nytt glykosyltransferas kallat YojK, som härstammar från Bacillus subtilis 168. Denna studie introducerar en genetiskt modifierad bakteriell glykosyltransferas, YojK-I241T/G327N, som kännetecknas av hög löslighet och katalytisk effektivitet, vilket erbjuder stor potential för industriell produktion av Reb D.
Utvecklingen av en mycket effektiv metod för produktion av rebaudiosid D med hjälp av en kaskadreaktion av YojK-I241T/G327N och AtSuSy-enzymer.
För att hantera problemet med låg löslighet i växtbaserade glykosyltransferaser undersökte forskare potentialen i att använda YojK, ett O-glykosyltransferas från Bacillus subtilis 168. YojK valdes på grund av dess påvisade glykosyleringsaktivitet med olika substrat, inklusive stora molekyler. Efter framgångsrik rekombinant uttryck och rening användes YojK för att glykosylera Reb A, vilket resulterade i produktionen av Stevia Reb D. Enzymkinetisk analys visade att YojK har lägre katalytisk aktivitet mot Reb D jämfört med andra glykosyltransferaser. Följaktligen antyder studien behovet av strukturstyrd ingenjörskonst för att förbättra YojK:s katalytiska aktivitet för potentiella praktiska tillämpningar. (som visas i Figur 1)
Figur 1
Optimering av reaktionsförhållanden för att uppnå en hög utbyte av rebaudiosid D.
Reaktionsförhållandena, inklusive pH, temperatur och substratkoncentration, kan optimeras för att uppnå en hög avkastning av Srevia Reb D. Studien använde molekylära dynamiksimuleringar för att undersöka hur varianten YojK-I241T/G327N förstärker Reb D-glykosylering. Varianten upprätthöll en stabil vätebindning mellan Reb A och H14 under simuleringar, till skillnad från vildtypen (som visas i figur 2). Denna stabilitet sträckte sig också till avståndet mellan Reb A:s O2-atom och UDPG:s C1P. YojK-I241T/G327N-variantens förbättrade katalytiska effektivitet tillskrevs dessa stabila interaktioner, vilket antyder dess praktiska potential.
Figur 2
Figur 3
Slutsats
Denna metod gav 83,47 % Reb D. Noterbart är att tillägget av 1 mM UDPG möjliggjorde syntesen av 20,59 g/L Reb D med en anmärkningsvärd utbyte på 91,29 %, vilket överträffade tidigare studier. Denna process visar potentialen för industriell produktion av Reb D, särskilt efter YojKs konstruktionsarbete.YojK kan uttryckas effektivt i E. coli BL21 (DE3) med hög löslighet. Genom strukturstyrd ingenjörskonst skapades en dubbelmutant, YojK-I241T/G327N, som möjliggjorde storskalig produktion av Reb D med en exceptionell utbyte på 91,29 % genom återvinning av UDPG katalyserad av sackarossyntasen AtSuSy. Denna studie presenterar YojK-I241T/G327N som ett lovande verktyg för ekonomiskt effektiv industriell produktion av Reb D.
