Tillväxtkopplad enzymteknik genom manipulation av regenerering av redoxkofaktorn

Ett allt bredare utbud av kemikalier produceras nu från förnybara råvaror genom bioteknologiska metoder. Bioprocesser är starkt beroende av enzymatisk katalys för effektiv produktion av dessa föreningar. Att säkerställa att enzymer fungerar optimalt i den miljö de behöver är därför av stort intresse för hållbar produktion.

Egenskaper som substratspecificitet, katalytisk hastighet och (termo)stabilitet är några av flera kritiska faktorer som måste optimeras för effektiva enzymdrivna bioprocesser. Denna optimering kan vara tidskrävande, kostsam och utmanande, och därför är det effektiva och kostnadseffektiva sätt som sannolikt är för tillväxtkopplad urval; ingenjörsenzymer med önskvärda egenskaper är mycket eftertraktade.

Fördelarna med att använda tillväxtkopplad selektion som en form av enzymselektion, vilket innebär att enzymets aktivitet kopplas till cellens tillväxt. Denna metod kan användas som en högkapacitetsselektionsstrategi och kan uppnås antingen genom att säkerställa att tillväxten är beroende av produktsyntes av målenzymet eller genom att koppla enzymets aktivitet till cellens globala energitillstånd. Syntetisk biologi kan användas för att konstruera stammar lämpliga för tillväxtkopplad selektion, och de senaste framstegen har fokuserat på att konstruera stammar som saknar oxiderade eller reducerade tillstånd hos redoxkofaktorpar, vilka kan fungera som enzymingenjörsplattformar. Användningen av dessa plattformar kan påskynda utvecklingen av förbättrade biokatalysatorer och bioprocesser.

Fördelar med tillväxtkoppling via kofaktorauxotrofi

Fördelarna med att använda kofaktorauxotrofi som urvalsmetod för att konstruera enzymer som ingår i biosyntesen av vissa kemikalier, såsom lipider, biobränslen, gaser, organiska lösningsmedel eller polymera föreningar. Denna metod erbjuder flera unika fördelar, inklusive möjligheten att välja den önskade produkten oberoende av det substrat eller den produkt som är intresserad, vilket gör det lättare att upptäcka förbättrad enzymatisk aktivitet och erbjuder en avläsning för att upptäcka förbättrad enzymatisk aktivitet. Dessutom är användningen av kofaktorauxotrofer som tillväxtkopplingsplattformar fördelaktig eftersom redoxkofaktorers allestädes närvarande natur i mikrobiell metabolism innebär att ingenjörsstrategier kan vara lateralt överförbara till andra mikrober av intresse, och enzymer kan direkt konstrueras inom den önskade mikrobiella värdens miljö. (visas som figur 1)

Figur 1: Jämförelse av flera allmänt använda screening-/urvalstekniker för enzymteknik

Mutanter som saknar NADH-oxidation

Oxidation av NADH i E. coli kan ske via två vägar, beroende på syretillgång. Under aeroba förhållanden oxideras NADH främst genom respiration för att generera ATP, medan det under anaeroba förhållanden kan oxideras genom jäsningsvägar för att producera laktat och etanol. Mutanta stammar av E. coli, som inte kan använda blandade fermenteringsvägar för NADH-oxidation under anaerob tillväxt, har använts för att driva NADH-oxidationsvägar för anaerob syntes av olika kemikalier, såsom 2-metylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol och L-alanin. Dessa mutantstammar har också använts för att konstruera enzymer genom att utnyttja liknande redoxprinciper, vilket resulterat i förbättrade varianter. De resulterande stammarna kan användas för att konstruera andra NAD(P)H-beroende enzymer och vägar.

Mutanter med brist på NAD+-reduktion  

Wenk et al. skapade en E. coli-stam genom att ta bort dihydrolipoyldehydrogenas (lpd)-genen, vilket resulterade i att stammen inte kunde generera reducerande energi (NADH och NADPH) från acetatmetabolismen på grund av avsaknad av pyruvatdehydrogenasaktivitet. Detta gjorde att stammen visade auxotrofi för att minska effekten när den odlades aerobiskt på acetat som enda kolkälla. (visas som figur 2) Stammen kunde växa på acetat när den kompletterades med övre glykolytiska substrat eller när NAD+-beroende format-, etanol- eller metanoldehydrogenaser uttrycktes med deras respektive substraten. Stammen användes inte för enzymteknik och bedömdes endast för redoxkofaktorauxotrofi.
 

Figur 2: Centralmetabolism 

Mutanter som saknar NADPH-oxidation

Det finns två olika strategier för att inducera NADP+-auxotrofi i E. coli, där man bygger på att konstruera den glykolytiska vägen för att överproducera NADPH. Den första strategin innebär att ta bort den ursprungliga gapA-genen och uttrycka ett heterologt NADP+-beroende GAPDH-enzym, medan den andra strategin innebär att omdirigera kolflödet via pentosefosfatvägen. De resulterande stammarna kan inte växa på glukos men visar tillväxt under olika förhållanden, där den första stammen odlas under anaeroba förhållanden och den andra under aeroba förhållanden med glycerol som substrat. Dessa stammar används för att konstruera enzymer med förbättrade egenskaper, inklusive substratspecificitet, katalytisk aktivitet och termostabilitet.

Mutanter som saknar NADP+-reduktion

Tre olika bakterier, E. coli, P. putida och C. glutamicum, har modifierats för att vara NADPH-auxotrofa, vilket innebär att de kräver exogen NADPH för tillväxt. I fallet med E. coli och C. glutamicum slogs centrala metabola enzymer ut för att undvika NADP+-reduktion när glukos tillfördes som kolkälla, medan CRISPR/nCas9-assisterad teknik i P. putida användes för att sekventiellt störa uppsättningar av målgener för att förstå deras inblandning i redoxmetabolismen. De NADPH-auxotrofa stammarna användes sedan för tillväxtkopplad enzymteknik baserad på kofaktorspecificitet. En enda omgång mutagenes med E. coli gav den mest effektiva och specifika NADP+-beroende formate dehydrogenasen hittills, medan P. putida och C. glutamicum representerar de första stammarna av sin art som kan användas för denna typ av ingenjörskonst.

Mutanter som saknar NMN+-reduktion

Ett tillväxtkopplat selektionssystem utvecklades för att koppla kofaktorcykling och tillväxt baserat på brist i NMN+-reduktion. E. coli SHuffle-stammen användes, som bär på deletioner i två gener som är involverade i produktionen av reducerad glutation. Ett NMNH-beroende glutathionreduktas utvecklades genom rationell mutagenes för att koppla processen till NMN+/NMNH-cykling, och ett NMN+-beroende glukosdehydrogenas användes för att stödja NMN+/NMNH-kofaktorcykling och därmed tillväxt. Studien använde också icke-kanonisk redoxkofaktorauxotrofi för tillväxtkopplad enzymteknik för första gången, vilket resulterade i en termostabil fosfitdehydrogenasvariant med förbättrad katalytisk effektivitet och tidsmässig stabilitet in vitro. Arbetet ger en användbar stam för tillväxtkopplad enzymteknik, beroende av NMN+/NMNH-cykling och auxotrof för det reducerade tillståndet av en icke-kanonisk redoxkofaktor.

Potentialen i tillväxtkoppling via redoxkofaktorer fungerade som ett kraftfullt verktyg för att konstruera biokatalysatorer, särskilt i kontexten av hållbar bioproduktion. Även om betydande framsteg har gjorts i genereringen av redoxkofaktor-auxotrofa stammar, antyder uttalandet att det fortfarande finns flera outforskade forskningsvägar. En av dessa involverar att konstruera kofaktor-auxotrofa stammar av organismer andra än E. coli, vilket kan öppna nya möjligheter för tillväxtkopplad enzymteknik.

Sammanfattningsvis antyder den att användningen av redoxkofaktorbaserad tillväxtkoppling utgör en stor möjlighet för ingenjörsbiokatalys, särskilt för produktion av produkter som inte kan uppfylla kraven från andra högkapacitetsenzymingenjörsmetoder. Den betonar behovet av att utveckla mer mångsidiga och effektiva biokatalysatorer för hållbar bioproduktion och betonar vikten av fortsatt forskning inom detta område.


Referens: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Tillväxtkopplad enzymteknik genom manipulation av regeneration av redoxkofaktor, Biotechnology Advances, 2023.