Kvantifiering av NAD+ och dess metaboliter i musens ischiasnerver
Introduktion
De avgörande delarna av nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD+) och dess metaboliter vid åldrande och neurodegeneration har blivit allmänt erkända. För att driva framsteg mot biokemisk forskning och interventioner riktade mot åldrande och neurodegenerativa sjukdomar är det av stor betydelse att noggrant kvantifiera NAD+ och dess metabolitnivåer i NAD+ räddningsvägen. Här används en robust och exakt LC-MS/MS-metod för att kvantifiera NAD+ och dess metabolitnivåer i normal och skadad mus ischiasnerv.Begränsningar hos befintliga metoder för kvantifiering av NAD+ och dess metaboliter
Traditionella metoder för att kvantifiera NAD+ och dess metaboliter, såsom HPLC-UV, NMR, kapillärzonselektrofores eller kolorimetriska enzymatiska analyser, står inför olika utmaningar vad gäller känslighet, selektivitet och indirekt mätning. När det gäller befintliga LC-MS/MS-analyser för cellulära eller vävnadsmätningar av NAD+ och dess metaboliter finns det fortfarande många svårigheter att övervinna, såsom förlängda körtider, dåligt kromatografiskt retentionsbeteende och otillfredsställande toppformer. Dessutom kan endast en till tre ämnen i NAD+ räddningsvägen täckas med dessa metoder.Modifieringarna av LC-MS/MS-metoden
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Dessutom är MS-förhållandena optimerade för att minimera NAD+-interferenssignalen i den cykliska adenosindifosfat-ribos (cADPR)-kanalen samtidigt som responsen från cADPR och nikotinamidmononukleotid (NMN) bibehålls, med 4000V för jonsprutspänning, 450°C för turbovärmarens temperatur, 50 psi för Gas 1, 50 psi för Gas 2, 30 psi för gardingas och 12 psi för kollisionsgas.
Representativ kromatogram av nervprover (normala vs skadade)
Alla fem analyter uppnår baslinjeseparation, där cADPR är en känslig biomarkör i neurodegenerationsmodellen. Här inducerar ischiasnervens axotomi axonal degeneration, vilket leder till minskad NAD+-nivå och förhöjd NMN-nivå i de skadade nerverna, vilket resulterar i en ungefär tvåfaldig ökning av NMN/NAD+-förhållandet. Samtidigt minskar nivåerna av nikotinamid (NAM) och adenosindifosfatribos (ADPR) med ungefär två saker, medan cADPR-nivån ökar med mer än 8 gånger. Dessa resultat stämmer överens med tidigare rapporterade forskningsresultat och verifierar noggrannheten hos denna modifierade LS-MS/MS-metod vid kvantifiering av NAD+ och dess metaboliter.
Slutsats
Denna modifierade LC-MS/MS-metod möjliggör effektiv baslinjeseparation av NAD+, NMN, NAM, ADPR och cADPR inom en kort körtid på 5 minuter, vilket bidrar till tidiga diagnoser av olika neurologiska sjukdomar och läkemedelsutveckling för åldrande och neurodegenerativa sjukdomar.Referens
Ma Y, Deng L, Du Z. Utveckling och validering av en LC-MS/MS-metod för kvantifiering av NAD+ och relaterade metaboliter i mus ischiasnerver och dess tillämpning på en nervskadad djurmodell. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC har sedan 2012 varit dedikerad till FoU, tillverkning och försäljning av råvaror för koenzym och naturliga produkter, med egenägda fabriker, över 170 globala patent samt ett starkt FoU-team. BONTAC har gedigen erfarenhet av forskning och utveckling och avancerad teknik inom biosyntes av NAD och dess föregångare (t.ex. NMN och NR). Det finns olika typer av NAD att välja, inklusive NAD ER Grade (endoxinborttagning), NAD Grade I (IVD/kosttillskott/kosmetika råpulver), NAD Grade II (API/intermediärer) och NAD Grade IV (om det finns högre krav på löslighet), som kan tillhandahållas i form av lyofiliserat pulver eller kristallint pulver. Renheten hos BONTAC NAD kan nå över 98%.
