Kvantifiering NAD+ och dess metaboliter i ischiasnerver hos möss
Införandet
De avgörande delarna av nikotinamid adenindinukleotid (NAD+) och dess metaboliter vid åldrande och neurodegeneration har blivit allmänt erkända. För att sporra framsteg mot biokemisk forskning och interventioner som riktar sig mot åldrande och neurodegenerativa sjukdomar är det av stor betydelse att noggrant kvantifiera NAD+ och dess metabolitnivåer i NAD+-räddningsvägen. Här används en robust och exakt LC-MS/MS-metod för att kvantifiera NAD+ och dess metabolitnivåer i normal och skadad ischiasnerv hos möss.
Begränsningar med befintliga metoder för att kvantifiera NAD+ och dess metaboliter
Traditionella metoder för att kvantifiera NAD+ och dess metaboliter, såsom HPLC-UV, NMR, kapillärzonelektrofores eller kolorimetriska enzymatiska analyser, står inför olika utmaningar inom känslighet, selektivitet och indirekt mätning. När det gäller befintliga LC-MS/MS-analyser för cellulära eller vävnads-NAD+ och dess metabolitmätningar, finns det fortfarande många svårigheter att övervinna, såsom förlängda körtider, dåligt kromatografiskt retentionsbeteende och otillfredsställande toppformer. Dessutom kan endast ett till tre ämnen i NAD+-räddningsvägen täckas av dessa metoder.
Modifieringarna av LC-MS/MS-metoden
På grundval av befintliga LC-MS/MS-analyser utförs modifieringar med avseende på de kromatografiska förhållandena, surrogatmatrisen och MS/MS-förhållandena. Specifikt används 5 μM metylenfosfonsyra som tillsats i mobil fas, vilket uttryckligen främjar signalintensiteten och toppformen. Med tanke på den relativt rena och enkla karaktären hos aldrig prover och deras lilla storlek, testas ultrarent vatten som en ersättningsmatris. Istället för hydrofil interaktion vätskekromatografikolonn och hyperkarbonkolonn används Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-kolonnen, vars unika MaxPeak HPS högpresterande ytteknik (passiverar kolonnens innervägg, eliminerar metallytan) möjliggör hög reproducerbarhet, toppsymmetri och baslinjeseparation av alla analyter.Dessutom är MS-förhållandena optimerade för att minimera NAD+-interferenssignalen i den cykliska adenosindifosfatriboskanalen (cADPR) samtidigt som svaret från cADPR och nikotinamidmononukleotid (NMN) bibehålls, med 4000V för jonsprayspänning, 450°C för turbovärmaretemperatur, 50 psi för gas 1, 50 psi för gas 2, 30 psi för gardinföras och 12 psi för kollisionsgas.
Representativt kromatogram av nervprover (normala vs skadade)
Alla fem analyterna uppnår baslinjeseparation, där cADPR är en känslig biomarkör i neurodegenerationsmodellen. Häri inducerar axotomi av ischiasnerven axonal degeneration, vilket leder till minskad NAD+-nivå och förhöjd NMN-nivå i de skadade nerverna, vilket resulterar i ungefär en 2-faldig ökning av NMN/NAD+-förhållandet. Samtidigt minskar nivåerna av nikotinamid (NAM) och adenosindifosfatribos (ADPR) med cirka 2 gånger, medan cADPR-nivån ökar mer än 8 gånger. Dessa resultat överensstämmer med tidigare rapporterad forskning, vilket verifierar noggrannheten hos denna modifierade LS-MS/MS-metod för att kvantifiera NAD+ och dess metaboliter.
Slutsats
Denna modifierade LC-MS/MS-metod möjliggör effektiv baslinjeseparation av NAD+, NMN, NAM, ADPR och cADPR inom en kort körtid på 5 minuter, vilket bidrar till tidiga diagnoser av olika neurologiska sjukdomar och läkemedelsutveckling för åldrande och neurodegenerativa sjukdomar.
Hänvisning
Ma Y, Deng L, Du Z. Utveckling och validering av en LC-MS/MS-metod för att kvantifiera NAD+ och relaterade metaboliter i möss ischiasnerver och dess tillämpning på en djurmodell för nervskada. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821
BONTAC NAD
BONTAC har ägnat sig åt FoU, tillverkning och försäljning av råvaror för koenzym och naturprodukter sedan 2012, med egenägda fabriker, över 170 globala patent samt ett starkt FoU-team. BONTAC har rik erfarenhet av forskning och utveckling och avancerad teknik inom biosyntes av NAD och dess föregångare (t.ex. NMN och NR). Det finns olika typer av NAD som ska väljas, inklusive NAD ER Grade (endoxinborttagning), NAD Grade I (IVD/kosttillskott/kosmetika råpulver), NAD Grade II (API/intermediärer) och NAD Grade IV (om något högre krav på lösligheten), som kan tillhandahållas i form av frystorkat pulver eller kristallint pulver. Renheten hos BONTAC NAD kan nå över 98 %.
Friskrivning
Denna artikel är baserad på referensen i den akademiska tidskriften. Den relevanta informationen tillhandahålls endast i syfte att dela med sig och lära sig och representerar inte någon medicinsk rådgivning. Om det finns någon överträdelse, vänligen kontakta författaren för radering. De åsikter som uttrycks i denna artikel representerar inte BONTAC:s ståndpunkt. Under inga omständigheter kommer BONTAC att hållas ansvarigt eller skadeståndsskyldigt på något sätt för några krav, skador, förluster, utgifter eller kostnader som uppstår direkt eller indirekt från din tillit till informationen och materialet på denna webbplats.